Bakterilerden Kromozom DNA’sı İzolasyonu

0
301

DENEYİN AMACI: Bakteri DNA’sının çıplak gözle görünür hale getirilerek incelenmesi,
yapı ve görevlerinin öğrenilmesi.
GENEL BİLGİ: Bakterilerde DNA çift zincirli (iplikli), çıplak ve tek bir halka
şeklindedir. Kromozomal DNA olarak adlandırılan yapıda bakterinin genetik materyali
bulunmaktadır. Ayrıca birçok bakteride kromozomal DNA’nın dışında genetik bilgi
taşıyan kromozom dışı, plazmid DNA’sına rastlanır. Plazmid DNA da kromozomal
DNA gibi çift iplikli, tek halkalı ve çıplaktır. Bazı koşullarda replikasyon yapabilir.
Görevi hücre çoğalması olmayıp, bakteriye
seçici avantaj sağlayan genleri taşımaktır. Bakteri genomundaki DNA ise genellikle
yüksek organizasyonlu canlılardaki kromozomun tanımına analog olarak kullanılır.
Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında genetik materyal DNA’dır. Bu nedenle
genetik materyalle yapılacak çeşitli çalışmalarda, moleküler biyoloji tekniklerinin
uygulanabilmesi için öncelikle yüksek molekül ağırlıklı DNA molekülünün, saf bir
şekilde elde edilmesi gerekmektedir.
DNA izolasyon yöntemlerinde, birbirini izleyen üç temel aşama bulunmaktadır:
1. Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması.
2. Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın
çözünür duruma getirilmesi.
3. DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer
makromoleküllerden ayrılması.
Bu aşamalardan sonra, farklı kaynaklı ya da farklı özellikteki DNA moleküllerinin
ayrılması gerekmektedir. Tek ve çift zincirli DNA moleküllerini ve plazmid DNA’sı ile
genomik DNA’yı birbirinden ayırmada da kromatografik tekniklerden yararlanılabilir.
MATERYALLER​:
Maya ekstresi(yeast extract)
Escherichia coli kültürü
Lurie Broth(LB) besi yeri, %0.5, pH 7.3
NaCl, %1
Tris-EDTA tamponu (TE), pH 8.0
Tris-HCl, 10 mM, pH 8.0
EDTA, 1 mM, pH 8.0
Sodyum dodesil sülfat (SDS), %10 Lizozim
Proteinaz K, 20 mg/ ml
NaCl, 5 M
CTAB (steril trimetil amonyum bromür), %10
CTAB/ NaCl
NaCl, 0.7 M
Kloroform/izoamil alkol, (24:1 v:v)
Fenol
Fenol/kloroform/izoamil alkol, (25:24:1 v:v:v)
İzopropanol
Etil alkol, %70
Mikropipet ucu, steril
Ependorf tüpü,
Mikrosantrifüj
DENEYİN YAPILIŞI: Çözeltilerin Hazırlanması:
LB Besi Yeri Hazırlanması:​ Maya ekstresi, 5 g/ L
Pepton (kazein), 10 gl L
NaCl,10g/L
Yukarıda verilen karışımı 1 L distile suda çözünüz (pH 7.0 +- 0.2) ve 121˚C’de
15dak. Otoklavda steril ediniz (kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesine dikkat
ediniz).
CTAB/NaCl Çözeltisinin Hazırlanması:​ NaCl, 4.1 g
Distile su, 90ml
CTAP, 10g
4.1 g NaCl’yi 90 ml distile suda çözünüz ve 10 g CTAB’i yavaşça ekledikten sonra
65°C’ye kadar ısıtarak karıştırınız.
Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol Karışımının Hazırlanması) : (25:24:1 v:v:v)
Fenol, 25ml
Kloroform, 24ml
İzoamil alkol, 1ml
Yukarıda verilen miktardaki maddeleri (ya da
5 ml LB besi yerinde tek koloniden ekim yapınız. 150 rpm hızda, 37°C’de bir gece
boyunca santrifüj yapınız.
Bir gecelik 5 ml bakteri kültürünün 1.5 ml’sini mikrosantrifüjde (10.000 rpm, 5 dak.)
santrifüjleyiniz.
Süpernatan (üst sıvı) uzaklaştırıldıktan sonra peleti 567 pl TE tamponu içerisinde
mikropipet yardımıyla çözünüz.
Çözelti üzerine 30 pl SDS ve 3 pl proteinaz K çözeltilerini ekleyerek hafifçe
karıştırınız ve 37˚ C’de 1 saat bekletiniz (bu aşamada hücreler lizis olur ve tüp
içindeki sıvı saydamlaşır).
100 pl 5 M NaCl ekleyerek karıştırınız. Daha sonra 80 pl CTAB/ NaCl çözeltisini
ekleyip karıştırarak 65°C’de 10 dak. bekletiniz.
Üzerine eşit hacimde kloroform/izoamil alkol ekleyiniz ve karıştırınız. 10.000 rpm
hızda, 5 dak. santrifüjleyiniz.
Süpernatanı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alınız ve eşit hacimde
fenol/kloroform/izoamil alkol karışımından ekleyerek karıştırınızt 10.000 rpm hızda,
5 dak. santrifüjleyiniz.
Süpernatanı dikkatli bir biçimde temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alıp 0.6 ml
izopropanol ekleyiniz. DNA çökünceye kadar karıştırınız (bu aşamada tüp altüst edilip
yavaş şekilde karıştırılırken DNA’nın iplikçikler şeklinde çökeldiği gözle görülebilir).
DNA’yı çöktürmek için 15.000 rpm hızda 10 dak. santrifüjleyiniz.
Polet üzerine 50 pl %70’lik etil alkol ekleyerek DNA’yı yıkayıp, tüpü hemen ters
çevirerek alkolü uzaklaştırınız.
Tüpü ağzı açık durumda oda sıcaklığında bir süre (10-15 dak.) veya 60°C’de birkaç
dakika bekleterek alkolün tamamen uçmasını sağlayınız.
Çökelti üzerine 50-100 pl TE ekleyiniz ve tüpe parmakla yavaşça vurarak DNA’yı
çözünüz.
İzole edilen DNA -20˚ C’de uzun süre saklanabilir.
bu oranlarda ) kullanarak homojen bir karışım yapınız.